|
|
Статьи Соросовского Образовательного журнала в текстовом формате
Описана последовательность событий в ходе инициации трансляции и сформулированы общие принципы функционирования рибосомных частиц в этом процессе. Обсуждается разделение функций между двумя рибосомными субчастицами при инициации трансляции. Генетические функции отнесены к малой рибосомной субчастице, тогда как биохимические - к большой.
БИОСИНТЕЗ БЕЛКА: ЭЛОНГАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДАИ ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ
А. С. СПИРИН
Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова
ВВЕДЕНИЕ
Трансляция одной кодирующей последовательности мРНК с производством одной завершенной полипептидной цепи включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Это так называемый эпицикл трансляции (см. статью "Принципы функционирования рибосом": Соросовский Образовательный Журнал. 1999. ╧ 4. Рис. 1). Инициация трансляции была рассмотрена в статье "Биосинтез белка: инициация трансляции" (Соросовский Образовательный Журнал. 1999. ╧ 5). Здесь будут описаны основные принципы, которые лежат в основе двух последующих стадий трансляции: элонгации и терминации.
Элонгация - это и есть собственно трансляция кодирующей последовательности мРНК рибосомой. Она имеет два аспекта: генетический (сканирование значащих кодонов мРНК) и биохимический (синтез полипептидной цепи). Когда сканирующая рибосома в процессе элонгации встречает так называемый незначащий триплет (то есть триплет нуклеотидов, не кодирующий никакой аминокислоты), то происходит терминация трансляции: синтез полипептида прекращается и он освобождается из рибосомы.
ПОЛЯРНОЕ ПОТРИПЛЕТНОЕ ДВИЖЕНИЕ РИБОСОМЫ ВДОЛЬ ЦЕПИ мРНК
После того как произошла инициация трансляции, рибосома осуществляет прочный комплементарный контакт связанных с ней молекул аминоацил-тРНК - инициаторной метионил-тРНК в Р-участке рибосомы и первой "элонгаторной" аминоацил-тРНК в А-участке - с двумя смежными триплетами (кодонами) мРНК (рис. 1, а ). В таком состоянии происходит реакция транспептидации между этими двумя аминоацил-тРНК, результатом чего является образование дипептидил-тРНК, связанной с триплетом (кодоном) в А-участке рибосомы (рис. 1, б ). При последующей транслокации остаток тРНК этой молекулы дипептидил-тРНК двигается из А-участка в Р-участок, таща за собой связанный с ней триплет мРНК (рис. 1, в ). В итоге цепь мРНК протаскивается относительно рибосомы ровно на один триплет нуклеотидов, и теперь в А-участке устанавливается смежный с предыдущим триплет нуклеотидов, то есть следующий кодон. (Более подробно описание событий при транспептидации и транслокации дано в статье "Принципы функционирования рибосом".)
Далее события происходят аналогичным образом: 1) аминоацил-тРНК, соответствующая (комплементарная) вновь установленному в А-участке кодону, связывается из окружающей рибосому среды с этим кодоном в А-участке (рис. 1, г ); 2) дипептидил-тРНК в Р-участке реагирует с новоявленной аминоацил-тРНК в А-участке путем транспептидации, что приводит к образованию трипептидил-тРНК в А-участке (рис. 1, д ), и 3) транслокация перебрасывает остаток тРНК молекулы трипептидил-тРНК из А-участка в Р-участок вместе со связанным с ней триплетом мРНК (рис. 1, е ) (см. также рис. 2 в статье "Принципы функционирования рибосом"). За этим следует аналогичный ряд событий (1-3), начинающийся с комплементарного связывания очередной аминоацил-тРНК с новым кодоном в А-участке.
Таким образом, благодаря триплет-триплетному связыванию (кодон-антикодоновому взаимодействию) между мРНК и тРНК в рибосоме, транслокация тРНК каждый раз приводит к протягиванию цепи мРНК относительно рибосомы ровно на три нуклеотида. Так как рибосома асимметрична и транслокация перемещает тРНК только однонаправленно из А-участка в Р-участок, потриплетное перемещение цепи мРНК оказывается тоже строго полярным, однонаправленным. В процессе трансляции (элонгации) оно может происходить только в направлении от 5'- к 3'-концу цепи.
В целом получается, что при трансляции (элонгации) рибосома работает как лентопротяжный механизм, перемещая с помощью тРНК цепь мРНК относительно себя с шагом по три нуклеотида. Важно отметить, что в процессе этого перемещения рибосома расплетает все попадающиеся на ее пути двуспиральные участки и более сложные элементы вторичной и третичной структуры мРНК.
У прокариотических организмов (бактерий), где ДНК не отделена мембраной от цитоплазмы и присутствующих там рибосом, последние начинают трансляцию на цепях мРНК, еще находящихся в стадии роста на комплексах ДНК с РНК-полимеразами (рис. 2). Другими словами, молекулы РНК-полимеразы ползут по ДНК и синтезируют цепи мРНК, начиная от 5'-конца РНК в направлении к 3'-концу, а рибосомы присоединяются к свешивающимся с полимераз 5'-концевым участкам, инициируют трансляцию и двигаются в процессе элонгации по направлению к молекуле полимеразы. Это явление получило название сопряженной транскрипции-трансляции. Интересно, что в бактериальных клетках скорость синтеза РНК (транскрипции) - около 30-45 нуклеотидов в секунду при 37?С - строго координирована со скоростью трансляции - около 10-15 триплетов в секунду, так что один триплет нуклеотидов синтезируется приблизительно за то же время, за которое он прочитывается и образуется одна пептидная связь. Таким образом, сопряжение транскрипции и трансляции у прокариот осуществляется как в пространстве (комплекс ДНК : РНК-полимераза: мРНК), так и во времени (координация скоростей транскрипции и трансляции).
У эукариот сопряжение транскрипции и трансляции невозможно. Во-первых, ДНК (хромосомы) эукариот отделены от цитоплазмы, содержащей рибосомы, ядерной мембраной. Эукариотическая мРНК синтезируется полностью в клеточном ядре, а лишь затем транспортируется из ядра в цитоплазму, где и встречается с рибосомами (см. статью "Принципы структуры рибосом": Соросовский Образовательный Журнал. 1998. ╧ 11. Рис. 1). Во-вторых, для инициации трансляции мРНК эукариотическими рибосомами требуется не только 5'-концевая часть мРНК, но и готовая 3'-концевая часть, являющаяся "усилителем" инициации (см. статью Л.П. Овчинникова "Что и как закодировано в мРНК": Соросовский Образовательный Журнал. 1998. ╧ 4). В отличие от бактерий скорость элонгации у эукариот варьирует в широких пределах, обычно от 1 до 10 триплетов в секунду, в зависимости от типа клеток, их физиологического состояния и природы транслируемой мРНК, будучи регулируема с помощью каких-то пока неизвестных клеточных механизмов.
ПОЛЯРНЫЙ РОСТ И СВОРАЧИВАНИЕ РАСТУЩЕЙ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
Согласно описанной выше картине (рис. 1), каждый раз вслед за связыванием аминоацил-тРНК с А-участком рибосомы происходит реакция транспептидации между этой аминоацил-тРНК (акцепторный субстрат) и сидящей в Р-участке молекулой пептидил-тРНК (донорный субстрат). Реакция приводит к замещению остатка тРНК в молекуле пептидил-тРНК на остаток аминоацил-тРНК, так что аминогруппа аминоацил-тРНК образует пептидную связь с карбоксильной группой пептидильного остатка (подробнее см. статью "Принципы функционирования рибосом", рис. 2 и 3):
NH2CH(CH2CH2SCH3)CO-NHCH(R')CO-tRNA' +
+ NH2CH(R")CO-tRNA"
NH2CH(CH2CH2SCH3)CO-NHCH(R')CO-
-NHCH(R")CO-tRNA" + tRNA'
Таким образом, в процессе элонгации в каждом шаге прочитывания триплета и транспептидации новый аминокислотный остаток добавляется к карбоксильному концу (или С-концу) пептида. Другими словами, рост пептида в рибосоме идет от N-конца к С-концу.
Итак, точкой роста пептида в рибосоме является его С-конец и, следовательно, в течение роста пептида его N-конец все более отодвигается от точки роста, то есть от пептидилтрансферазного центра рибосомы. Довольно скоро N-концевой сегмент растущего пептида высовывается из рибосомы в окружающую ее среду. Показано, что рибосома может вмещать не более чем 10-30 аминокислотных остатков растущего полипептида, считая от его С-конца или пептидилтрансферазного центра. Как правило, полные полипептидные цепи синтезируемых рибосомой белков состоят из 100-300 и более аминокислотных остатков. Это значит, что через какое-то время после начала трансляции N-концевая часть растущего полипептида оказывается вне рибосомы и затем по мере роста полипептида все большая часть его свешивается с рибосомы в среду.
Естественно, поскольку рибосому окружает физиологическая среда, а не денатурирующий раствор, полипептидная цепочка в такой среде не может оставаться в виде развернутой цепи: ее гидрофобные боковые группы взаимодействуют друг с другом, а гидрофильные - с окружающей водой и ионами. Это создает условия для сворачивания, компактизации и самоорганизации внерибосомной части растущего полипептида в пространственную (вторичную и третичную) структуру. Следовательно, сворачивание полипептида в компактную структуру происходит по мере его роста, то есть в течение трансляции, а значит, тоже полярно, от N-конца к С-концу. Такое постепенное полярное сворачивание растущей полипептидной цепи на рибосоме обозначается как котрансляционное формирование структуры белка (котрансляционное сворачивание). Рис. 3 иллюстрирует это на примере котрансляционного формирования глобулярной структуры глобина - субъединицы гемоглобина, кислородпереносящего белка крови.
В некоторых случаях белок, синтезируемый рибосомой, не предназначен для немедленного использования в клеточной цитоплазме, а должен быть сначала транспортирован через мембрану либо вне клетки, либо в одну из внутриклеточных органелл (например, в митохондрию или хлоропласт). Транспорт белков через мембрану требует несвернутого состояния их полипептидной цепи. В таких случаях используются две альтернативные стратегии: 1) рибосомы, синтезирующие белок, предназначенный для транспорта через мембрану, сами сидят на мембране (мембраносвязанные рибосомы), и растущий полипептид в развернутом виде поступает из них непосредственно в мембрану; 2) свободные (не прикрепленные к мембране) рибосомы цитоплазмы синтезируют полипептидную цепь, которая по мере выхода из рибосомы взаимодействует со специальными белками - молекулярными шаперонами. Шапероны препятствуют полному сворачиванию белка в компактную структуру и поддерживают его недосвернутое состояние в растворе. После освобождения из рибосомы эти недосвернутые белки взаимодействуют с мембраной и транспортируются через нее. Поддержание недосвернутого состояния белков шаперонами может требоваться также и для интеграции этих белков в надмолекулярные структуры клетки, для сборки четвертичных структур сложных белков, для вступления в комплексы с некоторыми лигандами и т.п. В этих случаях белки досворачиваются уже в составе указанных структур и комплексов.
ТЕРМИНАЦИЯ: ОСВОБОЖДЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДА И ДИССОЦИАЦИЯ РИБОСОМЫ
Сканируя цепь мРНК по триплетам и соответственно удлиняя полипептидную цепь, транслирующая рибосома доходит до конца кодирующей последовательности и встречается с одним из трех триплетов, не кодирующих аминокислоты и обозначаемых как стоп-кодоны, или кодоны терминации - UAG, UAA или UGA (раньше их называли незначащими, или бессмысленными, триплетами). В результате завершающей транслокации полипептидил-тРНК оказывается связанной с последним значащим триплетом в Р-участке рибосоме, а в А-участке устанавливается кодон терминации (рис. 4, а ). В клетке нет аминоацил-тРНК, способных комплементарно связываться с терминирующим кодоном, и потому А-участок не заполняется обычным акцепторным субстратом, каковым является аминоацил-тРНК. Вместо этого в дело вступают специальные белки, называемые факторами терминации, или факторами освобождения (release factors, RF). Один из них, RF1 (или похожий на него RF2), взаимодействует непосредственно с кодоном терминации в А-участке, а другой, RF3, при содействии первого и с участием ГТФ - с большой субчастицей рибосомы (рис. 4, б ) и, возможно, непосредственно с пептидилтрансферазным центром. Результатом связывания этих факторов с рибосомой является наведение гидролазной активности в рибосоме: пептидилтрансферазный центр рибосомы катализирует реакцию взаимодействия полипептидил-тРНК как донорного субстрата с молекулой воды как акцепторным субстратом:
NH2CHR'CO-(NHCHRCO)n-NHCHR*CO-tRNA* +
+ H2O
NH2CHR'CO-(NHCHRCO)n-NHCHR*COOH +
+ tRNA*.
Таким образом, связь между синтезированным полипептидом (его С-концом) и тРНК гидролизуется и полипептид уже не удерживается в рибосоме и освобождается в раствор в виде готового белка (рис. 4, в).
Заключительным актом терминации является выход деацилированной тРНК из Р-участка и диссоциация рибосомы на субчастицы. Диссоциация происходит спонтанно вследствие ослабления связи между двумя рибосомными субчастицами в отсутствие лигандов (пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК), и у бактерий может значительно ускоряться под действием специального белка, называемого фактором освобождения рибосом.
После диссоциации терминировавшей рибосомы на субчастицы малая субчастица не обязательно покидает мРНК: она может задержаться на ней и в случае полицистронных мРНК у прокариот (см. статью "Биосинтез белка: инициация трансляции") проскользнуть по цепи мРНК до начала следующей кодирующей последовательности и инициировать новую трансляцию (реинициация). Так как малая субчастица до инициации слабо удерживается на мРНК, то, если ей нечего реинициировать на этой же цепи мРНК, она скоро соскочит с нее и окажется среди пула свободных субчастиц цитоплазмы, готовых к инициации трансляции других мРНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, полный эпицикл трансляции состоит из стадий инициации, элонгации и терминации (см. статью "Принципы функционирования рибосом", рис. 1). На стадии элонгации происходит собственно трансляция кодирующей части мРНК. Эта стадия состоит из повторения элементарных элонгационных циклов, каждый их которых приводит к прохождению одного кодона мРНК и синтезу одной пептидной связи (см. статью "Принципы функционирования рибосом", рис. 2). Элонгационный цикл, в свою очередь, составляют три последовательных шага: связывание аминоацил-тРНК, транспептидация и транслокация. Сравнение стадий инициации и терминации с элонгационным циклом рибосомы приводит к выводу, что и они строятся похожим образом и могут рассматриваться как модифицированный элонгационный цикл.
Действительно, стадия инициации (см. статью "Биосинтез белка: инициация трансляции") начинается со связывания аминоацил-тРНК со специальной - инициаторной - аминоацил-тРНК. Так же как белковый фактор EF1 с ГТФ помогает связыванию аминоацил-тРНК в элонгационном цикле, гомологичный ему фактор IF2 с ГТФ помогает связыванию инициаторной метионил-тРНК при инициации. Отличие состоит в том, что инициаторное связывание аминоацил-тРНК происходит с малой субчастицей рибосомы, а не с полной рибосомой. Так как при инициации отсутствует второй субстрат, то никакой реакции транспептидации не может иметь места; этот шаг, свойственный элонгационному циклу, здесь отсутствует. Далее, когда к инициирующей малой субчастице присоединяется большая субчастица и образуется полная рибосома, инициаторная метионил-тРНК транслоцируется в Р-участок и имеются все основания полагать, что фактор IF2, осуществляющий гидролиз ГТФ, ведет себя подобно фактору транслокации EF2 в элонгационном цикле.
Стадия терминации еще больше напоминает элонгационный цикл. Она тоже начинается с шага связывания, но с кодоном терминации в А-участке связывается не аминоацил-тРНК, а белок RF1 (или RF2), рассматриваемый как аналог аминоацил-тРНК. Ему помогает белок RF3 с ГТФ, что похоже на роль EF1 с ГТФ при связывании аминоацил-тРНК в элонгационном цикле. Следующий шаг - реакция, катализируемая пептидилтрансферазным центром, но при терминации пептидный остаток перебрасывается не на очередную аминоацил-тРНК, как в элонгационном цикле, а на молекулу воды. Это аналог реакции транспептидации. Наконец, по-видимому, при участии RF3 с сопутствующим гидролизом ГТФ происходит что-то похожее на транслокацию: RF1 (или RF2) убирается из А-участка, а деацилированная тРНК - из Р-участка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш. шк., 1986. 300 с.
2. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1978. 700 с.
3. Buckingham R.H., Grentzmann G., Kisselev L. Polypeptide Chain Release Factors // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 24. P. 449-456.
4. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. Cotranslational Folding of Globin // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 10646-10651.
5. Zubay G. Biochemistry. Menlo Park (Calif.): Addison-Wesley Publ. Co, 1983. Ch. 26.
* * *
Александр Сергеевич Спирин, доктор биологических наук, профессор и зав. кафедрой молекулярной биологии МГУ, директор Института белка Российской академии наук, действительный член Российской академии наук и член Президиума Российской академии наук, член ряда международных и зарубежных академий и организаций, в том числе Европейской молекулярно-биологической организации (EMBO), Европейской академии (Academia Europea), Германской академии естествоиспытателей "Леопольдина", Американского философического общества. Основной круг научных исследований - структура и функция белоксинтезирующего аппарата, регуляция биосинтеза белков, бесклеточные системы биосинтеза белков, котрансляционное сворачивание белков. Редактор трехтомного учебника для вузов "Молекулярная биология" и автор одного их томов ("Структура рибосомы и биосинтез белка"), автор монографии "Рибосома" (два издания) на русском языке и трех монографий, изданных в США и Германии на английском языке ("Macromolecular Structure of Ribonucleic Acids" N.Y.: Reinhold, 1964; "The Ribosome" Heidelberg: Springer-Verlag, 1969; "Ribosome Structure and Protein Synthesis" Menlo Park: Benjamin/Cummings, 1986), переведенных также на другие языки. Автор около 300 публикаций в российских и международных журналах.
