|
|
Статьи Соросовского Образовательного журнала в текстовом формате
Представлены достижения в области исследований одной из перспективных в сельскохозяйственной практике групп ризобактерий - PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) рода Pseudomonas. Рассмотрены механизмы взаимодействия этих бактерий с растениями и фитопатогенами и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике.
РИЗОСФЕРНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА PSEUDOMONAS, СПОСОБСТВУЮЩИЕ РОСТУИ РАЗВИТИЮ РАСТЕНИЙ
А. М. БОРОНИН
Пущинский государственный университет
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами (рис. 1). Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ним прочные ассоциации как внутри корневых тканей, так и на корневой поверхности (ризоплане), а также в почве, непосредственно окружающей корни (ризосфере). В связи с этим в ризосфере и ризоплане в значительных количествах концентрируются бактерии, актиномицеты, грибы, водоросли и нематоды, существенно превышая количество этих же организмов в обычной почве. Одной из характеристик ризосферы различных растений, отражающей ее заселенность микроорганизмами, является количественное отношение R / S (rhizosphera / soil). Его нередко рассчитывают для различных видов, родов и семейств обитателей ризосферы. Величина R / S показывает, во сколько раз количество микроорганизмов определенной таксономической группы в ризосфере данного растения превышает количество этих микроорганизмов в почве. Для большинства бактерий величина R / S колеблется от 2 до 25. В ризосфере в отличие от свободной от корней почвы доминируют грамотрицательные бактерии, причем преобладают флуоресцирующие бактерии рода Pseudomonas. Некоторые штаммы бактерий Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. aureofaciens (chlororaphis), P. corrugata и др. способствуют значительному улучшению роста и развития растений. В настоящее время бактерии, обладающие совокупностью полезных для растений свойств, принято обозначать как PGPR (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, способствующие росту растений). Исследования этой перспективной для практического использования группы ризобактерий вызывают большой интерес, чем обусловлено регулярное проведение международных симпозиумов по проблеме изучения и практического использования PGPR. Среди PGPR различных таксономических групп выделяются широким набором полезных для растений свойств ризосферные PGPR Pseudomonas, которые являются потенциальными объектами агробиотехнологии для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений [1, 2].
МЕХАНИЗМЫ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО ВЛИЯНИЯ PGPR PSEUDOMONAS НА РАСТЕНИЯ
Все изученные к настоящему времени механизмы положительного влияния псевдомонад на растения можно условно разделить на два типа: 1) прямая или непосредственная стимуляция роста растений за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений; 2) опосредованная стимуляция роста растений за счет вытеснения и подавления развития почвенных фитопатогенов или микроорганизмов, угнетающих рост растений. К первому типу прежде всего можно отнести способность PGPR Pseudomonas синтезировать регуляторы роста растений и улучшать фосфорное питание растений. Кроме того, некоторые штаммы псевдомонад способны к фиксации атмосферного азота и индукции у растений устойчивости к фитопатогенам.
Прямая стимуляция роста растений
Синтез регуляторов роста растений. У ризосферных псевдомонад наиболее хорошо изучена способность к синтезу индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), которая, как известно, стимулирует развитие корневой системы растений. Однако большинство штаммов псевдомонад, стимулирующих рост растений, продуцируют ИУК в незначительных количествах (3-5 мкг/мл), тогда как псевдомонады, угнетающие рост растений, продуцируют до 20 мкг/мл ИУК. Исследования синтеза ИУК у PGPR Pseudomonas демонстрируют возможность получения генетически модифицированных штаммов PGPR Pseudomonas, способных к повышенному синтезу ИУК [3]. Перенос в PGPR Pseudomonas некоторых плазмид биодеградации нафталина также способствует увеличению уровня синтеза ИУК у ризосферных псевдомонад, что обусловлено наличием в составе этих плазмид гена, ответственного за синтез нафталиндиоксигеназы (первого фермента в пути окисления нафталина), вовлекаемого в процесс биосинтеза ИУК. Следует отметить, что помимо ИУК бактерии рода Pseudomonas могут продуцировать и другие регуляторы роста растений, как, например, гибберелинподобные вещества
Улучшение фосфорного питания растений. Фосфор присутствует в почве в виде органических (отложения растительного, животного и микробного происхождения) и неорганических или минеральных соединений. Из этого общего пула фосфорных соединений только около 5% доступны растениям. Некоторые микроорганизмы, в особенности микоризные грибы и некоторые ризобактерии, способны усиливать поступление фосфора в растения. Бактерии могут использовать две системы повышения концентрации экзогенного фосфата: 1) за счет гидролиза органических фосфатов под действием фосфатаз; 2) путем растворения минеральных фосфатов за счет продукции кислот. Бактерии рода Pseudomonas способны к эффективному растворению фосфорных соединений, что можно использовать для улучшения фосфорного питания растений (рис. 2).
Фиксация атмосферного азота. К настоящему времени известно немного азотфиксирующих штаммов псевдомонад и нет строгих доказательств того, что осуществляемый ими процесс азотфиксации вносит какой-либо существенный вклад в стимуляцию роста растений. Тем не менее роль PGPR Pseudomonas в процессах ассоциативной азотфиксации активно обсуждается, поскольку такие штаммы способны к непосредственной стимуляции роста растений при отсутствии фитопатогенов. Интересно, что в холодных климатических зонах в ризосфере растений азотфиксирующие псевдомонады доминируют над представителями других таксономических групп азотфиксаторов. Преимущество псевдомонад выражается в их холодоустойчивости, поскольку оптимальная температура для азотфиксации 14-20?С. В то же время для процесса азотфиксации других ассоциативных диазотрофов, как, например, бактерий рода Azospirillum, оптимальной температурой является 25?С. Несмотря на ограниченную информацию о роли азотфиксации в стимуляции роста растений псевдомонадами и слабую интенсивность этого процесса у псевдомонад, можно заключить, что ризобактерии Pseudomonas наряду с другими свободноживущими и ассоциативными диазотрофами родов Azotobacter, Bacillus, Klebsiella и Azospirillum могут играть существенную роль как в ассоциативных, так и в симбиотических азотфиксирующих сообществах, улучшая, к примеру, клубенькообразование у бобовых при совместном использовании с некоторыми штаммами Rhizobium и Bradirhizobium.
Индукция резистентности к фитопатогенам. Обработка растений авирулентными или несовместимыми формами фитопатогенов может индуцировать резистентность растений к заболеваниям. Аналогичный эффект достигается при инокуляции корней растений некоторыми штаммами PGPR Pseudomonas. Например, обработка корней бобов и гвоздики определенными штаммами PGPR P. putida повышает устойчивость растений к фитопатогенному грибу Fusarium solani. При этом отмечаются усиление лигнификации корневой ткани и повышение содержания фитоаллексинов в стеблях растений. При индукции резистентности у растений иногда трудно понять, вызывается ли это прямым или опосредованным воздействием бактерий на растения. Так, например, штамм P. fluorescens CHAО продуцирует помимо антибиотиков и сидерофоров цианистый водород и эффективно подавляет заболевание табака, вызываемое грибом Thielaviopsis basicola. Накопление цианистого водорода в корнях индуцирует устойчивость табака к указанному выше грибу, однако эта устойчивость в целом представляет собой результат действия не только цианистого водорода, но и опосредованных факторов (синтез сидерофоров и антибиотиков).
Опосредованная стимуляция роста растений
Бактерии рода Pseudomonas - одна из наиболее изученных групп бактерий-антагонистов почвенных фитопатогенов. К настоящему времени выделено множество штаммов ризосферных псевдомонад, подавляющих или замедляющих рост и развитие фитопатогенных грибов и бактерий. Литература, посвященная этому вопросу, настолько обширна, что не позволяет рассмотреть все аспекты проблемы в рамках данного обзора. Механизмы антагонистических взаимодействий псевдомонад и фитопатогенов весьма различны. Рассмотрим два из них, наиболее хорошо изученных и важных с точки зрения практического использования ризобактерий Pseudomonas.
Продукция сидерофоров. Хорошо известна способность псевдомонад продуцировать желто-зеленые флуоресцирующие водорастворимые пигменты, называемые сидерофорами, которые выполняют функцию связывания и транспорта железа в клетки бактерий. Сидерофоры флуоресцирующих псевдомонад имеют различную химическую структуру и обладают, как правило, высоким сродством к трехвалентному железу, образуя с ним стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами. Фитопатогены продуцируют собственные сидерофоры, однако в отличие от сидерофоров псевдомонад они гораздо медленнее связываются с ионами железа, и псевдомонады выигрывают в конкурентной борьбе с фитопатогенами за такой жизненно важный элемент, как железо. Таким образом, связывание железа сидерофорами псевдомонад приводит к ограничению роста фитопатогенов и улучшению роста растений.
Важная роль сидерофоров в антагонистических взаимоотношениях ризосферных псевдомонад с почвенными фитопатогенами и в стимуляции роста растений неоднократно доказана при инокуляции растений штаммами, продуцирующими сидерофоры, и их мутантами, дефектными по синтезу сидерофоров. При этом отмечено не только супрессирующее действие сидерофоров на фитопатогены, но и стимулирующее воздействие на растения. Это подтверждается также в экспериментах с очищенным сидерофором одного из штаммов P. putida - B10 псевдобактином, который оказывает стимулирующее действие на рост картофеля.
Следует отметить, что антагонизм псевдомонад в отношении фитопатогенов, обусловленный конкуренцией за железо, эффективен только при низком содержании железа в почве. Резко снижается защитный эффект сидерофорпродуцирующих штаммов в кислых почвах, где растворимость железа и его доступность для всех микроорганизмов возрастают. Избыток железа приводит также к репрессии синтеза сидерофоров. Помочь в решении этой проблемы могут дерепрессированные мутанты сидерофорпродуцирующих штаммов, способные к конститутивному синтезу сидерофоров, не зависящему от концентрации железа в почве. Возможность получения таких регуляторных мутантов продемонстрирована на одном из штаммов PGPR Pseudomonas sp. - M114.
Синтез антибиотиков. PGPR Pseudomonas способны продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов, в том числе антибиотиков [4]. Наиболее хорошо изученными антибиотиками, играющими важную роль в супрессии болезней растений, являются антибиотики группы феназинов, флороглюцинов, пиолютеорин, пирролнитрин и оомицин А (рис. 3, 4). Роль продукции антибиотиков в защите растений непосредственно в почве была показана в исследованиях Л. Томашов по бактеризации семян пшеницы штаммом P. fluorescens 2-79 и его дефектным по синтезу феназинового антибиотика (феназин-1-карбоновой кислоты) мутантом. Защиту растений от одного из возбудителей корневой гнили обеспечивал только исходный штамм с нормальной продукцией антибиотика, тогда как мутантный штамм хотя и не полностью, но в значительной степени утрачивал эту способность. Следует отметить, что мутанты PGPR Pseudomonas, характеризующиеся повышенным синтезом антибиотика, не улучшали защиты растений от фитопатогенов. Недавно была охарактеризована генетическая система, контролирующая биосинтез феназин-1-карбоновой кислоты у штамма P. fluorescens 2-79. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента геномной ДНК штамма 2-79 размером 8505 п.н., и в секвенированном участке локализованы три оперона - phzABCDEFG, phzI и phzR из области генов биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты. Изучена роль отдельных структурных генов в биосинтезе феназин-1-карбоновой кислоты в клетках E. coli, содержащих клонированные гены phz, а также в соответствующих мутантах P. fluorescens. Предложена принципиальная схема пути биосинтеза этого антибиотика [5].
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КОЛОНИЗАЦИЮ PGPR PSEUDOMONAS РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ
PGPR Pseudomonas могут оказывать положительное действие на растение только при успешной колонизации ими его ризосферы. В случае использования живых клеток PGPR Pseudomonas в качестве средств защиты растений от фитопатогенов речь идет об интродукции этих микроорганизмов в данную экологическую нишу. Поэтому чрезвычайно важно углубленное изучение процесса колонизации PGPR Pseudomonas ризосферы растений. Известно много факторов, влияющих на колонизацию бактериями корней растений и жизнедеятельность псевдомонад в почве и ризосфере.
Адгезия клеток к корневой поверхности. Важность этого фактора (способности ризобактерий прикрепляться к поверхности корней растений) продемонстрирована в экспериментах по адгезии клеток ризосферных псевдомонад к поверхности стерильных корней картофеля, редиса, бобов. Хотя к настоящему времени не идентифицированы соответствующие рецепторные молекулы на поверхности растительных и бактериальных клеток, имеются доказательства того, что в прикреплении клеток PGPR Pseudomonas к корням бобовых участвуют специфические антитела корневой поверхности.
Хемотаксис и подвижность клеток псевдомонад. Хемотаксис ризобактерий в направлении корневых эксудатов (способность бактериальных клеток перемещаться к корням растений, секретирующим широкий набор источников углеродного и азотного питания для микроорганизмов) показан многими исследователями. Однако роль хемотаксиса и подвижности клеток ризосферных псевдомонад в колонизации корней растений окончательно не выяснена. По данным одних исследований, подвижность флуоресцирующих псевдомонад является очень важным фактором колонизации корней картофеля, другие исследования не выявили какой-либо роли хемотаксиса и подвижности бактериальных клеток в колонизации корней.
Скорость размножения бактерий. До сих пор остается неясным влияние скорости размножения бактериальных клеток на колонизацию корней растений. По данным некоторых авторов, нет корреляции между временем генерации бактерий в лабораторных условиях и способностью штаммов колонизировать корни растений. Однако имеются работы, демонстрирующие повышенную способность к колонизации корней растений у PGPR Pseudomonas с более высокой скоростью роста в лабораторных условиях.
Выживаемость PGPR Pseudomonas в ризосфере. Для выживания в ризосфере бактерии должны адаптироваться к специфическим условиям этой экологической ниши. В частности, бактерии должны быть резистентны к губительным для них ферментам (пероксидазы, протеазы) или токсичным соединениям (фенольные соединения растений), а также обладать в некоторых случаях осмо- или холодотолерантностью. Например, осмотолерантность или устойчивость псевдомонад к высушиванию является очень важной характеристикой для сельскохозяйственной практики, поскольку эти бактерии неспособны образовывать покоящиеся или защитные формы типа цист или спор. В работе Лопер с соавторами показана прямая корреляция осмотолерантности и размеров популяций для восьми штаммов псевдомонад на корнях картофеля. В то же время некоторые чувствительные к осмотическому шоку мутанты штамма P. putida MK280 способны хорошо колонизировать корни хлопка в условиях сухой почвы. Отсутствие других данных по влиянию осмотолерантности псевдомонад на их выживаемость и эффективность в ризосфере указывает на необходимость специальных исследований.
Биотическими факторами, влияющими на выживаемость ризобактерий, является наличие в ризосфере конкурентов или других организмов, оказывающих негативный эффект на PGPR Pseudomonas, таких, как простейшие (амебы и инфузории), хищные бактерии и бактериофаги. Эти факторы плохо изучены и имеются только отдельные сведения о такого рода взаимодействиях. Например, есть данные о том, что присутствие в почве специфического бактериофага значительно ухудшает колонизацию корней сахарной свеклы чувствительным к этому фагу штаммом PGPR Pseudomonas. В настоящее время показано наличие бактериофагов у флуоресцирующих бактерий рода Pseudomonas, однако отсутствуют какие-либо данные об их роли во взаимодействии ризосферных бактерий и растений.
PGPR PSEUDOMONAS КАК АГЕНТЫ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕНОВ
Возможность применения биологических, и в частности микробиологических, объектов для защиты растений от фитопатогенов исследуется около 70 лет. Специалисты, занимающиеся этой проблемой, часто называют биологическую защиту растений с помощью других организмов биологическим контролем фитопатогенов [6]. В начале 80-х годов интерес к биологическому контролю резко возрос в связи с появляющимися возможностями получения биопрепаратов и биотехнологий, конкурентных химическим средствам защиты растений.
Рассмотренные выше механизмы антагонизма ризосферных псевдомонад и фитопатогенов являются основными, но не единственными механизмами опосредованной стимуляции роста растений. Очень часто биологический контроль фитопатогенов ризосферными псевдомонадами представляет собой результат комплексного действия различных механизмов, включающих помимо синтеза сидерофоров и антибиотиков и другие менее изученные пока способы воздействия ризобактерий Pseudomonas на почвенных патогенов. При этом возможно одновременное супрессирующее влияние псевдомонад на фитопатогены как за счет синтеза сидерофоров, антибиотиков и других вторичных метаболитов, так и за счет простой конкуренции PGPR Pseudomonas и фитопатогенов за источники азотного и углеродного питания.
Одним из примеров такого рода является штамм P. fluorescens CHAO. Биологический контроль фитопатогенного гриба Thielaviopsis basicola наблюдается в результате суммарного эффекта как минимум трех вторичных метаболитов, образуемых штаммом CHAО, а именно: сидерофора пиовердинового типа, антибиотика 2,4-диацетилфлороглюцина и цианистого водорода. Практически во всех случаях биологический контроль ризосферными псевдомонадами почвенных фитопатогенов представляет собой суммарный эффект комплексного действия ряда механизмов. При этом в различных условиях (состав почвы, температура, рН) превалируют разные механизмы. Например, синтез сидерофоров в условиях кислого рН или повышенной температуры у псевдомонад подавлен и основными механизмами в биологическом контроле могут стать синтез антибиотиков или конкуренция с фитопатогенами за источники питания. Весьма вероятно, что не все механизмы, вносящие свой вклад в биологический контроль фитопатогенов у ризосферных псевдомонад, выявлены и изучены.
Биологический контроль псевдомонадами фитопатогенов in vitro является до сих пор одним из основных критериев отбора практически полезных штаммов PGPR Pseudomonas. Однако скрининг штаммов-антагонистов in vitro имеет существенный недостаток. Антагонизм in vitro и in vivo не всегда коррелирует, что требует обязательной проверки штамма-антагониста в опытах на растениях.
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ PGPR PSEUDOMONAS
Обработка посевного материала, а также корней и проростков растений некоторыми штаммами PGPR Pseudomonas может существенно снижать пораженность растений фитопатогенами и увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур. Использование таких штаммов в сельскохозяйственной практике, по мнению многих исследователей, уже в ближайшее время найдет широкое применение в современной агробиотехнологии. В некоторых случаях возможно использование смешанных препаратов совместимых бактерий, в том числе и бактерий различных таксономических групп с обязательным включением бактерий рода Pseudomonas. Использование таких препаратов может преследовать различные цели: защиту растений и урожая от фитопатогенов, стимуляцию прорастания семян и роста растений, улучшение фосфорного питания растений, стимуляцию образования клубеньков у бобовых, получение компостов, супрессирующих возбудителей корневых гнилей растений и т.д. Наши исследования наглядно демонстрируют перспективность использования некоторых ризосферных штаммов псевдомонад в сельскохозяйственной практике [7]. Широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ризосферных бактерий рода Pseudomonas сдерживается отсутствием стандартных технологий их производства. В настоящее время ведутся разработки технологий получения биопрепаратов различного назначения на основе ризосферных псевдомонад. Исследуются различные способы консервации этих биопрепаратов и улучшения их прикрепления к поверхности семян и корней растений с использованием различных клеящих средств типа метилцеллюлозы, альгинатов, ксантанов и др. Кроме того, успешно развиваются исследования антагонистических взаимоотношений ризосферных псевдомонад с фитопатогенными нематодами, вызывающими значительные потери урожая. Проводятся эксперименты по переносу в ризосферные псевдомонады бактериальных генов других таксономических групп (например, Bacillus thuringiensis), контролирующих необычные для псевдомонад свойства, как, например, способность к синтезу токсинов, вызывающих гибель некоторых насекомых - вредителей растений.
О перспективах практического использования PGPR Pseudomonas можно судить по списку уже разработанных биопрепаратов на основе PGPR Pseudomonas:
1) BlightBan A506 - продуцент P. fluorescens A506, используется для защиты растений от заморозков;
2) BioSave - продуцент P. syringae ESC 6-10, используется для защиты цитрусовых и плодовых деревьев от грибных патогенов;
3) Blue-Circle - продуцент P. cepacia type Wisconsin, используется против Fusarium, Pythium и сосущих нематод;
4) Intercept - продуцент P. cepacia, используется для защиты вегетирующих растений кукурузы, хлопка от Pythium sp., Rhisoctonia solani, Fusarium sp.;
5) Victus - продуцент P. fluorescens NCIB 12089, используется против бактериальной пятнистости растений.
В России в настоящее время зарегистрирован единственный биопрепарат на основе P. fluorescens под коммерческим названием "ризоплан". На заключительной стадии регистрации находится биопрепарат на основе штамма P. aureofaciens BS1393 (коммерческое название "псевдобактерин"), успешно прошедший полевые испытания в качестве средства защиты для зерновых и овощных культур от фитопатогенов (рис. 5).
Таким образом, уже в настоящее время возможно эффективное использование штаммов PGPR Pseudomonas, правильно подобранных к конкретным условиям определенного хозяйства в качестве биологических средств защиты растений, являющихся дополнением, а иногда и альтернативой химическим средствам. Активно ведущиеся исследования в этом направлении и разрабатываемые новые технологии существенно повысят эффективность этих биопрепаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Schroth M.N., Hancock J.G. Disease - Suppressive Soil and Root-Colonizing Bacteria // Science. 1982. Vol. 216. P. 1376-1381.
2. Соколов М.С., Литвишко Е.В. Биологическая защита растений в США // Защита растений. 1993. ╧ 11. С. 18-20.
3. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я., Боронин А.М. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т. 34, ╧ 3. С. 287-292.
4. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук. думка, 1990. С. 84-111.
5. Мавроди Д.В., Ксензенко В.Н., Чатуев Б.М. и др. Структурно-функциональная организация генов Pseudomonas fluorescens, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты // Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 76-82.
6. Cook R.J., Baker K.F. The Nature and Practice of Biological Control of Plants Pathogens // St. Paul (Minn.): Amer. Phytopathol. Soc., 1989. P. 1-539.
7. Ермолаева Н.И., Иванова Н.И., Скворцова Н.П. и др. Применение биометода в открытом и защищенном грунте: Использование ризосферных бактерий рода Pseudomonas для предпосевной обработки огурцов, капусты и картофеля // Защита растений. 1992. ╧ 8. С. 24-25.
* * *
Александр Михайлович Боронин, доктор биологических наук, профессор, ректор Пущинского государственного университета, директор Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, член-корреспондент Российской академии наук. Область научных интересов: микробиология и генетика микроорганизмов, биология бактериальных плазмид, генетические аспекты деградации ксенобиотиков. Автор более 300 публикаций в отечественных и зарубежных изданиях.
