|
|
Статьи Соросовского Образовательного журнала в текстовом формате
Экспрессия генов у эукариот управляется прилегающими к генам регуляторными элементами - промоторами или отстоящими от них участками ДНК (усилителями), находящимися в той же молекуле ДНК (хромосоме). В то же время активные или, наоборот, репрессированные состояния генов могут определяться пространственным расположением хромосом относительно друг друга или локализацией хромосом на определенной ограниченной территории внутри ядра. Рассмотрены случаи конъюгации гомологичных участков хромосом, сопровождающиеся как активацией генов, так и подавлением генной активности. Обсуждаются представления о разграничении в ядре территорий, занимаемых активными и инактивированными генами.
ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ ХРОМОСОМВ КЛЕТОЧНОМ ЯДРЕ ОПРЕДЕЛЯЕТ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ
В. А. ГВОЗДЕВ
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
ВВЕДЕНИЕ
Регуляция транскрипции генов эукариот рассмотрена ранее [1]. Транскрипцию осуществляет РНК-полимераза, которая связывается с промотором и вместе с несколькими дополнительными белками обеспечивает умеренный (базальный) уровень транскрипции генов, тогда как высокий, индуцированный уровень транскрипции (например, зависимый от гормонов) достигается с помощью дополнительных активаторных белков, в том числе и тех, которые связываются с усилителем транскрипции - энхансером. Активная транскрипция требует изменения нуклеосомной структуры хроматина [1, 2] в регуляторных районах гена. Нуклеосомы, которые включают четыре пары молекул разных белков-гистонов, на которые навита ДНК ("бусины на нитке", см. подробнее в [2]), удаляются из регуляторных районов гена, смещаются и закрепляются на определенных расстояниях от старта транскрипции. Освобожденные от нуклеосом участки становятся доступными для связывания с активаторными белками. Важнейшим достижением последних лет является обнаружение способности белков, связывающихся в районе промотора с РНК-полимеразой, модифицировать нуклеосомную структуру в близлежащих регуляторных районах гена.
Регуляторные элементы генов (промоторы и энхансеры), находящиеся вблизи старта транскрипции в той же хромосоме, называют цис-действующими. Однако кроме цис-действующих элементов в процессы регуляции активности генов могут вовлекаться взаимодействия разных хромосом - так называемые транс-взаимодействия. Природу транс-взаимодействий следует рассматривать с учетом наших знаний о цис-действующих регуляторных системах. Транс-взаимодействия также осуществляются благодаря образованию крупных белковых комплексов, связывающихся с ДНК. Затем белок-белковые взаимодействия обеспечат ассоциации хромосом друг с другом. Можно ожидать, что транс-взаимодействия будут зависеть от расположения хромосом в пространстве ядра. В свою очередь, ассоциации ДНК-белковых комплексов могут создавать определенную внутриядерную архитектуру хромосом.
Рассмотрим случаи транс-взаимодействий, способных приводить как к активации, так и к инактивации генов. Программа развития организма включает как активацию, так и репрессию отдельных генов в разных клетках и тканях. Губительным для организма может оказаться не только отсутствие данного белка, но и его нерегулируемый избыточный синтез.
КОНЪЮГАЦИЯ ХРОМОСОМ
В ЯДРАХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Клетки тела многоклеточных эукариот имеют диплоидный (двойной) набор хромосом, складывающийся из гаплоидных наборов хромосом отца и матери. В тканях зародышевого пути при образовании гамет гомологичные хромосомы в процессе мейоза конъюгируют друг с другом, что обеспечивает последующий процесс обмена участков хромосом - кроссинговер. Однако и в соматических клетках, в особенности у насекомых, наблюдали спаривание гомологичных хромосом. Уже в начале XX века высказывали предположение, что такое взаимодействие хромосом необходимо для функционирования генов в покоящейся, неделящейся клетке. Однако прошли десятки лет, прежде чем были представлены доказательства в пользу этой гипотезы.
Поясним, как можно следить за конъюгацией участков хромосом в интерфазном неделящемся ядре. Раньше исследования конъюгации хромосом в соматических клетках ограничивались в основном гигантскими, многократно дуплицированными по своей длине политенными хромосомами, которые обнаруживаются в ядрах клеток слюнных желез личинок насекомых [3]. Как известно, хромосомы становятся видимыми в световом микроскопе лишь перед митозом, когда осуществляются процессы компактизации и конденсации нуклеопротеиновых нитей интерфазных хромосом [2]. Однако лишь сравнительно недавно стало возможно выявлять и в неделящемся интерфазном ядре конъюгацию участков деконденсированных, лишенных плотной упаковки гомологичных хромосом, представленных отцовским и материнским наборами. Были разработаны специальные методы исследования, основанные в конечном итоге на флуоресцентной микроскопии хромосом. Обычно проводят гибридизацию меченого фрагмента ДНК определенного гена с препаратами клеток и тканей. Используют фрагмент ДНК, содержащий пиримидиновые основания, ковалентно связанные с биотином. Биотин прочно связывает белок авидин (или стрептавидин), который можно пометить флуоресцирующим красителем. Меченный биотином зонд гибридизуется с хромосомами в районе расположения данного гена, а затем с находящимся в составе ДНК биотином свяжет флуоресцирующий белок. В результате точечная флуоресценция будет указывать на положение гена в данном участке ядра. Если гомологичные гены находятся в неспаренных хромосомах, то в интерфазном диплоидном ядре можно видеть две отдельные светящиеся точки. При спаривании хромосом две точки сливаются в одну. Применение этой методики к исследованию конъюгации генов, кодирующих гистоны, иллюстрирует рис. 1, А. Можно видеть, что спаривание локусов, содержащих гистоновые гены, отсутствует в раннем развитии и наблюдается только на более поздних стадиях развития. К сожалению, пока остается невыясненным, каким образом спаривание может сказываться на активности этих генов.
ТРАНСВЕКЦИЯ
Явление трансвекции обнаружено у дрозофилы. Трансвекцией называют случаи восстановления (по крайней мере частично) нормального фенотипа в результате взаимодействия по-разному поврежденных генов, находящихся в разных хромосомах, если нет препятствий для спаривания гомологичных хромосом и сближения поврежденных генов в соматических клетках. Конъюгация хромосом предотвращается структурными перестройками, например инверсиями, когда участок одной из гомологичных хромосом разворачивается на 180?. Явления трансвекции, наблюдаемые в соматических клетках, были описаны сравнительно недавно. В то же время генетики давно знали, что конъюгация хромосом в мейозе и последующий обмен участками хромосом (кроссинговер) подавляются при структурных перестройках хромосом.
Рассмотрим явление трансвекции на примере гена дрозофилы, транскрипция которого управляется отдаленным от старта транскрипции энхансером - усилителем транскрипции. С энхансером связываются регуляторные белки, способные образовывать крупные белковые комплексы (рис. 1, Б, 1 ). Белковый комплекс может контактировать с РНК-полимеразой или белками-активаторами. Рассмотрим случай, когда каждая из хромосом в отдельности неспособна обеспечить образование необходимого белкового продукта. Например, в хромосоме а поврежден собственно ген, кодирующий белок, а в хромосоме б нарушена транскрипция вследствие повреждения энхансера. Однако конъюгация гомологичных хромосом обеспечивает контакт связанного с энхансером белкового комплекса в хромосоме а с промотором неповрежденного гена в хромосоме б (рис. 1, Б, 2 ). В результате ген в хромосоме б будет активно транскрибироваться, если хромосомы смогут конъюгировать, и восстановится нормальный фенотип клетки и организма. На необходимость спаривания хромосом для восстановления активности гена указывало следующее наблюдение: при наличии перестройки в одной из хромосом, например инверсии (рис. 1, Б, 3 ), нарушающей только конъюгацию хромосом и не повреждающей районы гена, восстановления нормального фенотипа не наблюдали. Рассмотренный случай трансвекции показывает, что возникновение инверсии в одной из гомологичных хромосом может приводить не только к нарушению обмена участками хромосом в мейозе, но и к изменению функционирования генов в соматических клетках. Заметим, что точки разрыва, ограничивающие инвертированный участок, могут лежать достаточно далеко от взаимодействующих регуляторных элементов.
Молекулярный механизм трансвекции напоминает способ действия энхансера, далеко отстоящего от промотора. Однако при трансвекции активация осуществляется благодаря спариванию участков разных хромосом, то есть в результате транс-взаимодействий различных хромосом, а не цис-взаимодействий в пределах одной хромосомы. Трансвекцией в широком смысле называют также такие транс-взаимодействия генов, которые могут сопровождаться как активацией, так и инактивацией генов. В основе описанных к настоящему моменту явлений трансвекции могут лежать разные, еще не раскрытые молекулярные механизмы.
Процесс спаривания хромосом в неделящемся интерфазном ядре, вероятно, требует определенного времени. Поэтому спаривание генов гистонов (см. рис. 1, А ) не наблюдается на ранних стадиях развития, когда одно деление клетки за другим следует слишком быстро и гомологичные участки хромосом не успевают найти друг друга в течение короткого промежутка времени между митозами. Следовательно, регуляция активности гена, в основе которой лежит трансвекция, будет наблюдаться только в том случае, если отрезок времени между митозами будет достаточным для того, чтобы гомологичные участки хромосом успели "узнать" друг друга. Предполагается, что броуновское движение участков хромосом, расположенных в ограниченных территориях ядра, способствует подобному узнаванию. Случаи активации экспрессии генов в результате подобных транс-взаимодействий недавно выявлены и в клетках млекопитающих. Правда, такая возможность обнаружена пока только в экспериментах с культурами клеток.
Рассмотрим случаи репрессии генов, обусловленные транс-взаимодействиями участков разных хромосом. Подобным образом регулируется активность генов, определяющих план строения тела (см. [4, 5]).
РЕПРЕССИЯ ГЕНОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ПЛАН СТРОЕНИЯ ТЕЛА,
В РАЗВИТИИ ОРГАНИЗМА
Сходные системы генов определяют становление плана тела как у насекомых, так и у позвоночных. Это гены-селекторы, определяющие судьбу делящихся клеток развивающегося организма, предназначенных для формирования того или иного участка тела. Впервые такие гены были обнаружены у дрозофилы. Нарушение регуляции экспрессии генов-селекторов приводит к превращению одних участков сегментированного тела в другие. Классический пример - появление мухи с лишней парой крыльев. Мутации таких генов были найдены у дрозофилы, затем эти гены были изолированы (клонированы) с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Позднее сходные гены были обнаружены у позвоночных. У позвоночных, как и у дрозофилы, вследствие нарушения регуляции экспрессии генов-селекторов наблюдаются различные дефекты развития. Так, например, задние позвонки превращаются в передние, из задних в передние могут превратиться зачатки отделов развивающегося мозга. В развитии дрозофилы реализуется строгая программа работы разных генов-селекторов в участках тела эмбриона, из которых формируются определенные сегменты тела взрослого насекомого, например грудные сегменты (с крыльями и жужжальцами) или брюшные сегменты, расположенные ближе к концу тела. У дрозофилы при нарушении программированной репрессии гена, необходимой для нормального развития пары крыльев n-го сегмента, последний ведет себя как расположенный ближе к концу тела (n + 1)-й сегмент. В результате образуются два (n + + 1)-х сегмента и сформируются две пары жужжалец (рис. 2, А). Инактивация гена в сегменте n + 1 превратит его в сегмент n, в таком случае у мухи будут две пары крыльев (см. рис. 2, А ). Селекторные гены, определяющие план строения организма, получили также название гомеозисных от греческого слова homeosis, что означает образование структуры "не на месте". Эти гены кодируют регуляторные белки, узнающие энхансеры и промоторы других генов-мишеней, функционирование которых необходимо для нормального развития. Гены-мишени, в свою очередь, могут кодировать белки - рецепторы гормонов, а также секретируемые клетками и диффундирующие в ткани регуляторные белки, определяющие скорость делений клеток и клеточные контакты. Гомеозисные гены, отвечающие за строение плана тела, часто находятся по соседству друг с другом. В длинных интронах этих генов (см. [1]) и в протяженных межгенных областях находятся регуляторные участки этих генов. На долю экзонов (участков генов, кодирующих белок) приходится всего лишь 2% ДНК. Остальные 98% ДНК содержат регуляторные элементы - энхансеры или, напротив, участки, ответственные за репрессию этих генов (рис. 2, Б ).
Оказывается, что репрессия гена, как и его активация, определяется образованием крупного белкового комплекса в регуляторных районах гена. С участками ДНК (Р), расположенными рядом с геном или внутри гена (в интронах), взаимодействует белок Р (показан фиолетовым кружком) (рис. 2, В ), узнающий в ДНК определенные нуклеотидные последовательности ("мотивы") подобно тому, как активаторные белки узнают места связывания с промоторами и энхансерами [1]. Связывание белка является первым этапом в "заякоривании" с данным районом ДНК (рис. 2, В, а) комплекса разных белков. Прочное подавление активности гена определяется присоединением к белку P еще нескольких дополнительных белков. Однако только белок Р узнает нуклеотидную последовательность ДНК, остальные компоненты комплекса присоединяются к нему за счет белок-белковых взаимодействий. Белки помогают друг другу образовать крупный, состоящий из разных белков (гетеромультимерный) комплекс. Такие взаимодействия белков называют кооперативными. Следующий уровень взаимодействий - это ассоциации гетеромультимеров за счет белок-белковых связей. В один комплекс объединяются участки одной хромосомы или разных хромосом (см. рис. 2, В, а, б ), при этом прочность комплекса увеличивается, а степень репрессии генов повышается. Структура хроматина, включающего промотор и энхансер, становится более плотной, компактной, регуляторные районы уже недоступны для белков-активаторов. Различия в составе взаимодействующих белков в разных репрессорных комплексах могут определять специфичность репрессии различных гомеозисных генов.
Успешность взаимодействия между белковыми комплексами может определяться конфигурацией хромосом в ядре. Взаимодействуют как разные хромосомы, так и разные сайты на одной хромосоме, расположенные друг от друга на расстояниях нескольких тысяч нуклеотидных пар. Взаимодействие комплексов на разных хромосомах резко усилит репрессию гена (см. рис. 2, В, а, б ). Репрессия может распространяться на десятки тысяч нуклеотидных пар от того места, где начал формироваться первый гетеромультимерный комплекс. Р-районы ДНК обладают разной способностью организовывать репрессорные мультимерные комплексы белков. Р-районы кооперативно взаимодействуют друг с другом, и в результате Р-участки, каждый из которых в отдельности неспособен организовать стабильный репрессорный комплекс, становятся компонентами репрессорной структуры, достаточно прочной и наследуемой в клеточных поколениях.
Существование таких комплексов, число которых в ядре ограничено, удается показать с использованием иммунофлуоресценции, если в руках исследователей имеются антитела, специфически связывающиеся с одним из белков мультимерного комплекса (см. рис. 2, В, в). Антитела, узнающие разные белки комплекса, могут выявить идентичные картины распределения светящихся точек в пространстве ядра. Следовательно, в образовании ограниченного числа центров репрессии гомеозисных генов участвуют разные кооперативно взаимодействующие друг с другом белки.
Белки, сходные с теми, которые участвуют в репрессии гомеозисных генов дрозофилы, были обнаружены и в клетках человека. Оказалось, что гены, кодирующие эти белки у позвоночных, могут быть протоонкогенами, нарушение функций которых приводит к нерегулируемой активации генов, следствием чего являются неограниченное деление клеток и рост опухолей. Это открытие иллюстрирует исключительную плодотворность исследований на модельном объекте - дрозофиле, которые позволяют обнаруживать новые молекулярные механизмы возникновения опухолей.
ЭФФЕКТЫ ПОЛОЖЕНИЯ ГЕНОВ
И ВНУТРИЯДЕРНЫЕ ТЕРРИТОРИИ АКТИВНЫХ И НЕАКТИВНЫХ ГЕНОВ
Точечная внутриядерная локализация взаимодействующих друг с другом репрессорных комплексов указывает на существование упорядоченной пространственной организации неактивных участков генома. Предполагается существование в пространстве ядра территорий, занимаемых активными и неактивными, молчащими генами. Эти представления основаны в значительной степени и на исследовании давно известного, хотя и остающегося загадочным явления эффекта положения гена. Эффект положения - это инактивация гена при его перемещении из эухроматиновых в гетерохроматиновые районы хромосом, например при хромосомных перестройках, вызванных облучением. Геном эукариот разделен на эухроматин и гетерохроматин [6]. Гетерохроматин представлен районами хромосом, прилегающими к центромере и концам хромосом (теломерам) (рис. 3, А ). Эухроматин содержит основную массу генов, тогда как гетерохроматин насыщен разными типами повторяющихся в геноме последовательностей ДНК, в том числе и подвижными элементами [7]. Гетерохроматические районы хромосом изредка содержат жизненно важные гены, но, как правило, представлены генетически инертным материалом. Возможные функции гетерохроматина остаются до сих пор в значительной степени невыясненными, хотя на его долю приходится существенная часть ДНК, нередко до 30% по массе. Представления о существовании в ядре территорий активных и неактивных генов сложились в результате рассмотрения случаев инактивации генов эухроматина (эффектов положения гена) при их попадании в результате хромосомных перестроек в район теломеры или центромеры гетерохроматина (см. рис. 3, А ).
Неактивные состояния генов эухроматина, попавших в районы теломеры или центромеры, наследуются в ряду клеточных поколений. Ген сам по себе не повреждается, поскольку показано, что инактивация гена обратима: ген может реактивироваться в последующих клеточных поколениях. Эффекты положения демонстрируют наследуемую, но обратимую, так называемую эпигеномную инактивацию гена в отличие от необратимой инактивации при повреждении нуклеотидной последовательности ДНК, вызванном мутацией. В результате нестабильно наследуемой инактивации гена ткань будет содержать как мутантные по фенотипу клетки, так и нормальные. За фенотипом можно следить по образованию пигмента, если речь идет об эффектах положения генов, определяющих, например, окраску глаз у дрозофилы или окраску клеток дрожжей. При инактивации гена будут образовываться неокрашенные участки ткани у дрозофилы или непигментированные колонии клеток дрожжей рядом с окрашенными, где ген работает, обеспечивая накопление пигмента. Инактивация генов при эффекте положения как у дрожжей, так и у дрозофилы осуществляется, как и при репрессии селекторных генов, путем образования связывающихся с ДНК гетеромультимерных репрессорных комплексов, характерных для районов гетерохроматина. Как и в случае селекторных генов, инактивация гена, попавшего в гетерохроматин, в значительной степени зависит от пространственных межхромосомных взаимодействий. Это, например, хорошо показано для теломерного эффекта положения у дрожжей. Теломеры дрожжей конъюгируют друг с другом и располагаются на периферии ядра, связываясь с внутренней ядерной мембраной (рис. 3, Б ). Несмотря на малые размеры ядра и хромосом дрожжей, методы гибридизации и иммунофлуоресценции (см. выше) позволяют выявлять в ядре местоположение как теломерных районов ДНК, так и специфических регуляторных белков, обеспечивающих подавление активности генов в этих районах. Одна из функций теломер состоит в предотвращении укорочения линейных молекул ДНК при репликации [8]. Другая функция связана с обеспечением пространственной организации хромосом в ядре. В районе теломер, как и в регуляторных районах гомеозисных генов дрозофилы, собирается комплекс репрессорных белков, кооперативно взаимодействующих друг с другом. Кооперативная сборка белков обеспечивает распространение репрессорного комплекса с конца хромосомы на некоторое расстояние внутрь тела хромосомы. Репрессорные белки в теломерах хромосом дрожжей способны также прочно связываться с белками внутренней ядерной мембраны и служат своеобразным мостиком, организующим внутриядерную ориентацию хромосом. В результате реализуется так называемый теломерный эффект положения у дрожжей, сопровождающийся нестабильной, но наследуемой инактивацией эухроматинового гена, попавшего в теломерный гетерохроматин.
Подобные исследования, указывающие на существование активных и неактивных внутриядерных территорий, ведутся и на клетках позвоночных. Отметим, что внутриядерная локализация активных и неактивных участков хромосом представляет собой достаточно сложную мозаику. Например, неактивные гетерохроматиновые области ядра, о которых шла речь, не совпадают с внутриядерными районами расположения репрессированных селекторных генов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Накопился большой экспериментальный материал, показывающий роль пространственной внутриядерной локализации хромосом в определении активности генов в эукариотической клетке. Основные результаты получены на модельных объектах - дрозофиле и дрожжах, хотя есть основания считать, что этот способ регуляции активности генов свойствен и позвоночным, и растениям. Обнаружено, что в активации/инактивации гена могут играть существенную роль как взаимодействие разных хромосом друг с другом, так и расположение гена на внутриядерной территории, запрещающей или, напротив, разрешающей экспрессию гена. Выявлены регуляторные элементы генов, отвечающие за взаимодействие разных хромосом или участков одной хромосомы, далеко отстоящих друг от друга. Известны белки, образующие крупные комплексы, ответственные за этот тип взаимодействий. Однако остается невыясненной роль структурных элементов ядра, например его внутренней оболочки, во внутриядерной организации хромосом. Вопросы, касающиеся молекулярных механизмов перемещения хромосом в ядре и принципов разделения внутриядерного пространства на функционально различные территории, также ждут своего решения.
Наследуемые в клеточных поколениях активные или неактивные состояния гена, определяемые межхромосомными взаимодействиями или расположением гена в определенном внутриядерном пространстве, носят эпигеномный характер, то есть они не связаны с изменением нуклеотидной последовательности ДНК и являются обратимыми. Молекулярные механизмы эпигеномного наследования в этих случаях остаются полностью загадочными в отличие от других известных примеров наследуемого переключения активности генов, где существенную роль играют процессы обратимого метилирования ДНК [9]. Познание разнообразных механизмов эпигеномного наследования представляется сейчас одной из самых актуальных проблем молекулярной генетики эукариот.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гвоздев В.А. Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. ╧ 2. С. 22-31.
2. Ченцов Ю.С. Современные представления о строении митотических хромосом // Там же. ╧ 8. С. 14-22.
3. Жимулев И.Ф. Современные представления об организации и функционировании политенных хромосом // Там же. 1997. ╧ 1. С. 2-7.
4. Жимулев И.Ф. Действие генов в раннем развитии дрозофилы // Там же. 1998. ╧ 7. С. 2-7.
5. Корочкин Л.И. Ведение в генетику развития. М.: Наука, 1999. 253 с.
6. Жимулев И.Ф. Молекулярная и генетическая организация гетерохроматина в хромосомах дрозофилы // Соросовский Образовательный Журнал. 2000. Т. 6. ╧ 2. С. 76-82.
7. Гвоздев В.А. Подвижная ДНК эукариот // Там же. 1998. ╧ 8. С. 8-14.
8. Богданов А.А. Теломера и теломераза // Там же. ╧ 12. С. 12-18.
9. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК // Там же. 1999. ╧ 10. С. 11-17.
Рецензент статьи Л.И. Корочкин
* * *
Владимир Алексеевич Гвоздев, доктор биологических наук, профессор, зав. отделом молекулярной генетики животных Института молекулярной генетики РАН, член-корреспондент РАН. Лауреат Государственной премии СССР. Область научных интересов - структура и функция генов эукариот. Соавтор учебника по молекулярной биологии, автор более 130 работ.
