|
|
Статьи Соросовского Образовательного журнала в текстовом формате
Рассмотрен принципиально новый подход к флуоресцентной диагностике сложных органических соединений, основанный на определении их молекулярных фотофизических параметров из кривых насыщения флуоресценции. Приведены некоторые результаты решения соответствующей обратной задачи.
НЕЛИНЕЙНАЯ ФЛУОРИМЕТРИЯ СЛОЖНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙВ. В. ФАДЕЕВ
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
ВВЕДЕНИЕ
Сложные органические соединения играют большую роль в природе, широко используются в самых различных технологиях. Поэтому разработка методов и средств их обнаружения, измерения концентрации и определения состояния (то есть методов диагностики) была и остается актуальной научной и технической проблемой. Особый интерес представляют сложные органические соединения, которые входят в состав природных сред и живых организмов или которые попадают в эти объекты, а иногда специально вводятся в них с теми или иными целями.
Очевидно, что наиболее ценными являются такие методы и средства, которые обеспечивают диагностику без разрушения объекта (то есть in vivo), непосредственно в среде обитания сложного органического соединения (то есть in situ), с высокой чувствительностью, экспрессно, а в ряде случаев (например, в системах экологического мониторинга) дистанционно.
НЕСКОЛЬКО СЛОВ О КЛАССИЧЕСКОЙ (ЛИНЕЙНОЙ) ФЛУОРИМЕТРИИ
Природа преподнесла нам подарок: многие органические соединения обладают способностью флуоресцировать при оптическом возбуждении с квантовым выходом, достаточным для решения диагностических задач. Все они обладают полосами флуоресценции, положение, форма и интенсивность которых могут быть использованы для диагностики указанных соединений.
Флуориметрия как метод спектрального анализа и диагностики сложных органических соединений обладает достоинствами, делающими ее чрезвычайно привлекательной [1]. Во-первых, полоса флуоресценции смещена (и иногда весьма значительно) в длинноволновую область спектра относительно полосы поглощения, что позволяет при регистрации флуоресценции отстраиваться от фона, создаваемого упругим рассеянием фотонов на неоднородностях среды (рассеянием Рэлея и Ми), и эффективно подавлять этот фон. Во-вторых, сечение флуоресценции для хорошо флуоресцирующих соединений настолько велико, что позволяет регистрировать флуоресценцию сред с чрезвычайно низкой концентрацией флуоресцирующих молекул. Флуориметрия - один из самых чувствительных методов оптической спектроскопии.
Замена обычных источников возбуждающего излучения на лазеры значительно улучшает характеристики флуоресцентного анализа в классическом варианте (в частности, еще больше поднимает чувствительность). Но главная, принципиально новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции - нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия [2], которой посвящена данная статья. Но прежде чем перейти к изложению физических основ этого нового метода спектроскопии, посмотрим, так ли велика необходимость в этом методе. А для этого укажем на трудности (и подчас весьма серьезные), с которыми сталкивается классическая (линейная) флуориметрия. Для разных объектов в различных задачах диагностики эти трудности проявляются по-разному. Для определенности рассмотрим, какие препятствия возникают на пути решения задач диагностики природных органических комплексов (ПОК) в водных средах.
Первое препятствие - большая ширина полос флуоресценции ПОК и перекрытие полос разных ПОК, одновременно присутствующих в природных водах. Определяющий вклад в спектр флуоресценции этих сред дают четыре класса ПОК: фотосинтезирующие организмы - фитопланктон, водное гумусовое вещество, аминокислоты в свободном состоянии или в составе белковых соединений, нефти в виде пленки на поверхности, эмульсии и в растворенной форме в объеме воды. На рис. 1 показан фрагмент спектра оптического отклика природной воды при ее возбуждении излучением с длиной волны lexc = 266 нм (это длина волны 4-й гармоники излучения лазера на кристалле иттрий-алюминиевого граната, легированного ионами неодима - ИАГ :Nd-лазера). Обратим внимание на то, что в спектре помимо полос флуоресценции ПОК присутствует полоса комбинационного (рамановского) рассеяния света молекулами воды. Это очень важный компонент спектра, который широко используется для диагностики водных сред. В частности, он может выступать в качестве внутреннего репера, на который нормируется интенсивность флуоресценции ПОК.
Второе препятствие - идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса ПОК, поскольку, как правило, флуоресцирующие центры в них одни и те же, например пигмент хлорофилл а в водорослях, составляющих фитопланктон.
Третье препятствие. Изменение состояния ПОК, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации ПОК по интенсивности флуоресценции и не дает возможности проводить диагностику состояния ПОК (например, фотосинтетической активности водорослей).
Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики ПОК невозможно в рамках только феноменологического подхода, то есть оперируя лишь спектрами излучения и возбуждения флуоресценции, хотя, конечно, эти спектры дают большой объем информации. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. При этом указанные параметры необходимо измерять in vivo и in situ, причем в условиях дефицита информации о локальных концентрациях молекул в ПОК.
В настоящее время единственный способ измерения указанных параметров - нелинейная флуориметрия (флуориметрия насыщения). Важно подчеркнуть, что на этом пути решаются не только прикладные задачи диагностики ПОК, но и фундаментальные проблемы: установление механизмов фотофизических процессов (на молекулярном уровне) при взаимодействии оптического излучения с ПОК; выявление природы полос флуоресценции; изучение генезиса и трансформации ПОК в воде, например изучение происхождения водного гумусового вещества или процессов трансформации нефтей и нефтепродуктов в воде (процесса старения).
МОДЕЛИ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СЛОЖНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ И КОМПЛЕКСАХ.
КРИВЫЕ НАСЫЩЕНИЯ
При достаточно больших значениях интенсивности (плотности потока фотонов) возбуждающего излучения F зависимость регистрируемого числа фотонов флуоресценции Nfl(F ) отклоняется от линейной - насыщается (рис. 2). Причин для такого насыщения флуоресценции может быть несколько. Наиболее физически понятная состоит в следующем. Если плотность потока фотонов F столь велика, что среднее время между их попаданиями в площадку, численно равную сечению поглощения молекулы sabs , меньше времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, то молекула не успевает вернуться в основное состояние к моменту попадания в нее следующего фотона и этот фотон пролетает мимо молекулы - мы (при величине квантового выхода флуоресценции h = 1) лишаемся одного фотона флуоресценции (если слой среды оптически тонкий, то есть sabs ln0 ! 1, где l - толщина слоя, n0 - концентрация молекул). Это явление обеднения основного состояния приводит к просветлению слоя среды и нелинейной зависимости Nfl(F ) - к насыщению флуоресценции. Есть и другие механизмы насыщения флуоресценции, на них мы укажем позже. Очевидно, что параметры кривой насыщения Nfl(F ) определяются фотофизическими характеристиками молекулы и, следовательно, эти характеристики могут быть определены по параметрам кривой насыщения. Решение такой обратной задачи и составляет существо нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) как метода спектрального анализа любых флуоресцирующих атомов и молекул. Особенно актуален этот метод применительно к сложным органическим соединениям и комплексам.
Какой бы алгоритм решения обратной задачи ни использовался, мы должны располагать теоретической (расчетной) кривой насыщения флуоресценции, которая может быть получена путем решения системы кинетических (скоростных) уравнений для населенностей энергетических состояний флуоресцирующих молекул.
Узловым моментом этой процедуры является рациональный выбор физической модели, описывающей взаимодействие оптического излучения с ансамблем флуоресцирующих органических молекул или комплексов. В математической формулировке это определяет число параметров, подлежащих определению при решении обратной задачи.
Для сложных органических молекул в случае, когда можно пренебречь взаимодействием между ними, приоритетными параметрами, влияющими на кривую насыщения, являются (рис. 3 [1]): а) сечение поглощения sabs ╞ s13 , определяющее вероятность перехода молекулы из основного синглетного состояния S0 (c уровня 1 ) в первое возбужденное синглетное состояние S1 (уровень 3 ) под действием потока фотонов с плотностью F (см- 2 " с-1); б) время жизни t3 молекулы в состоянии S1 , то есть на уровне 3 ; в) квантовый выход молекул в нижнее триплетное состояние T1 (на уровень 2 ) в результате перехода S1 T1 , называемого интеркомбинационной конверсией: где и - скорости излучательных и безызлучательных переходов из S1 в S0 ; - скорость перехода S1 T1 .
Параметр ki j (его размерность с-1) характеризует вероятность перехода с уровня i на уровень j таким образом, что если ni - концентрация молекул в исходном состоянии i, то ki jni - число молекул (в единице объема), перешедших за 1 секунду из состояния i в состояние j. В рассматриваемой модели имеются три канала дезактивации уровня S1 , которые характеризуются параметрами и Поэтому полное число молекул (в единице объема), покидающих уровень S1 в 1 секунду, равно k3n3 и, следовательно, - время жизни этого уровня.
Число фотонов флуоресценции, испущенных элементом объема dV = dx dy dz в интервале времени от t до t + dt,
где - концентрация флуоресцирующих молекул, находящихся в возбужденном состоянии S1 (на уровне 3 ), z - координата вдоль лазерного пучка, а - в его поперечном сечении. Тогда полное число фотонов флуоресценции, испущенное объемом V за время от t = 0 (начало лазерного импульса) до t = ?,
где S - площадь сечения пучка, l - толщина слоя, из которого регистрируется флуоресцентный отклик (следовательно, V = Sl ).
Осталось определить величину Для этого используют систему кинетических уравнений, которые являются по существу представителями широкого класса уравнений баланса. К этому классу, в частности, относится и уравнение баланса в популярной задаче о бассейне: скорость изменения объема (или массы) воды в бассейне равна разности (балансу) скоростей поступления воды в бассейн и вытекания из него. Аналогично для нашей задачи мы должны написать уравнения, определяющие скорости изменения концентраций n1 , n3 , n2 молекул на уровнях S0 , S1 и T1 (их называют населенностями уровней), и равенство, отражающее закон сохранения частиц:
n1 + n2 + n3 = n0 ,
где n0 - концентрация молекул.
Для примера напишем одно из этих скоростных уравнений - для населенности n3 (в пренебрежении межмолекулярными взаимодействиями):
Первый член в правой части уравнения означает скорость поступления молекул на уровень S1 за счет их перехода с уровня S0 под действием потока фотонов возбуждающего излучения; второй член - скорость ухода молекул с уровня S1 в результате излучательных (k31) и безызлучательных () переходов S1 S0 и безызлучательной интеркомбинационной конверсии S1 T1 (). Это уравнение вместе с аналогичными уравнениями для n2 и n1 образует систему линейных дифференциальных уравнений, которая может быть решена и, следовательно, найдена величина
Реально мы часто сталкиваемся с объектами, описание фотофизических процессов в которых требует использования более сложных моделей. Например, в упомянутых выше органических комплексах, присутствующих в природных водах, локальная концентрация молекул, участвующих в формировании флуоресцентного отклика комплекса, настолько велика ($10- 3 моль/л), что необходимо ввести в модель параметры, описывающие процессы переноса энергии между молекулами.
Кинетические уравнения для таких объектов становятся значительно более сложными если не по форме, то по содержанию входящих в них параметров. Вместо уравнения (3) получаем (для краткости опускаем аргументы)
где s* - сечение возбуждения флуоресцирующих молекул (флуорофоров) в комплексе. Оно определяется не только сечением поглощения флуорофоров s13 (как это было в (3)), но и параметрами, определяющими перенос энергии с других молекул комплекса на молекулы флуорофоров; - полная скорость дезактивации возбужденных молекул флуорофора, включающая в себя как скорость внутримолекулярной дезактивации k3 , так и скорость переноса энергии с молекул флуорофора на другие молекулы комплекса; g - константа скорости синглет-синглетной аннигиляции возбужденных молекул флуорофора, обусловленная эффектом переноса энергии между двумя возбужденными молекулами флуорофора (в каждом таком акте взаимодействия уничтожается по крайней мере одно из двух возбужденных состояний молекул).
Таким образом, уравнение (4) отличается от уравнения (3) не только наличием нелинейного члена но и существенно большей смысловой нагрузкой на остальные параметры, ибо в них содержится информация о межмолекулярных взаимодействиях.
Найдя величину n3(F ) путем решения системы, содержащей уравнения вида (3) или (4), и подставив ее в интеграл (1), получаем зависимость Nfl(F ). Как было сказано выше, эта зависимость называется кривой насыщения флуоресценции (рис. 2, 4, 5). Теоретически рассчитанные и экспериментально измеренные кривые насыщения представляют собой исходные данные для решения обратной задачи нелинейной флуориметрии.
Различные фотофизические параметры оказывают разное влияние на характеристики кривой насыщения, что и дает принципиальные возможности их раздельного определения путем обработки одной кривой насыщения. Сказанное иллюстрируется рис. 4, который наглядно показывает, что насыщение флуоресценции пигментов хлорофилла а в клетках водорослей намного сильнее, чем насыщение тех же пигментов в слабо концентрированном растворе ацетона. Причина таких различий заключается в том, что помимо динамического объединения основного состояния действует еще один механизм насыщения флуоресценции - синглет-синглетная аннигиляция, причем из-за очень высоких локальных концентраций пигментов в клетках водорослей (от 0,1 до 1 моль/л) этот эффект становится доминирующим. Сказанное подтверждается и расчетом (см. рис. 5).
ОБРАТНЫЕ ЗАДАЧИ
ФЛУОРИМЕТРИИ НАСЫЩЕНИЯ
Зная характеристики кривой насыщения, можно в принципе определить фотофизические параметры молекулы или комплекса. Задачи такого рода называются обратными. В общем случае они являются некорректными [3]. Однако, используя априорную информацию о фотофизических процессах, формирующих флуоресценцию сложных органических соединений и комплексов, можно ограничить число параметров модели и пределы их изменения так, чтобы задача стала корректной по А.Н. Тихонову [3], то есть удовлетворяла трем условиям: решение существует, решение единственно и устойчиво. В нашей задаче устойчивость гарантирована ограниченностью числа восстанавливаемых параметров: в рассмотренных к настоящему времени обратных задачах нелинейной флуориметрии число определяемых параметров варьировали от одного до трех и в будущем оно едва ли превысит пять. Что касается единственности решения, то она доказана для трехпараметрической модели, описываемой системой кинетических уравнений с определяемыми параметрами Таким образом, эта обратная задача является корректной по А.Н. Тихонову. Есть все основания полагать, что добавление четвертого параметра - константы скорости синглет-синглетной аннигиляции g не приведет к утрате этого свойства, хотя здесь требуется отдельное доказательство.
Теоретически устойчивая обратная задача может стать неустойчивой на практике. Причинами практической неустойчивости являются погрешности (шумы) входных данных и отклонение реальных процессов от модели, по которой рассчитывают теоретические зависимости (в нашем случае кривые насыщения). Практическая неустойчивость возникает, когда шумы входных данных или отклонение процессов от модели превышают некоторые допустимые величины. Пороги возникновения практической неустойчивости зависят как от характера фотофизических процессов в объекте, так и от свойств алгоритма решения обратной задачи. В общем случае кривые насыщения флуоресценции - исключительно неблагоприятный класс входных данных для обратных задач. Как видно из рис. 2, 4, 5, это монотонные кривые без каких-либо резких элементов, за которые можно было бы "зацепиться". Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при весьма низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Однако это имеет место при использовании наиболее распространенного метода решения обратных задач - метода наименьших квадратов (МНК) [3, 4]. В его основе лежит процедура минимизации функционала невязки между экспериментальными и теоретическими данными путем вариации искомых параметров в ограниченном объеме их возможных значений. Если экспериментальная кривая неидеальна (снята с большими погрешностями или не соответствует теоретической модели), одного интегрального параметра (невязки) оказывается недостаточно, чтобы найти наилучшую аппроксимирующую кривую, рассчитанную для значений параметров модели в допустимой (из физических соображений) области их значений.
Некоторое время ситуация казалась тупиковой, и метод нелинейной флуориметрии мог умереть, не успев родиться. На помощь пришла современная компьютерная техника искусственных нейронных сетей (ИНС) [5]. Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор:
где y - значение выходной величины, T - передаточная функция (обычно нелинейная), xi - значения входных величин, wi - веса связей. ИНС состоит из нескольких слоев нейронов. Входной слой имеет количество нейронов, равное количеству элементов в наборе входных данных, в нашем случае количеству точек на кривой насыщения. Выходной слой должен иметь число нейронов, совпадающее с числом определяемых параметров. На первом этапе работы сети происходит ее обучение на известных данных с целью получения наилучшей матрицы весов wi . Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных.
Применительно к нашей обратной задаче принципиальное отличие техники ИНС от традиционного метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Набор этих признаков формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Как показали модельные расчеты (численные компьютерные эксперименты) [2], алгоритмы решения обратных задач, основанные на технике ИНС, уже сейчас обеспечивают вполне приемлемую практическую устойчивость решения, а ведь возможности ИНС в этой области далеко не исчерпаны.
В табл. 1 приведены результаты определения параметров s* и gn0 для некоторых природных органических комплексов (g - константа скорости синглет-синглетной аннигиляции, n0 - локальная концентрация флуоресцирующих молекул, поэтому gn0 - максимальное значение скорости этого процесса) по экспериментальным кривым насыщения с использованием метода ИНС. По порядку величины полученные значения параметров s* и gn0 соответствуют ожидаемым.
Измерение величин s*, gn0 и других фотофизических параметров ПОК in vivo и in situ позволяет продвинуться в решении разнообразных задач, связанных с этими объектами природы, в частности использовать указанные параметры для более тонкого качественного анализа, чем это позволяют сделать только спектры флуоресценции. Данные, приведенные в табл. 1, подтверждают сказанное.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Насыщение флуоресценции сложных органических соединений - один из многих нелинейных эффектов, возникающих в лазерных пучках и сформировавших новый, современный облик оптики. Использование этих эффектов в спектральном анализе привело к созданию нелинейной спектроскопии с ее принципиально новыми, часто уникальными возможностями. Долгое время флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) стояла в стороне от этого процесса. В данной статье мы постарались показать, что и в этой области спектроскопии может быть развит нелинейный подход, основанный на измерении кривых насыщения флуоресценции. Возможность определять молекулярные фотофизические параметры сложных органических соединений и комплексов, в том числе и природных, без их разрушения и извлечения из среды (in vivo и in situ), делает этот метод весьма привлекательным для ряда областей науки и техники: в экологическом мониторинге, биологии и медицине, технологии.
В рамках одного метода нелинейной флуориметрии (и, следовательно, на одном приборе) могут быть одновременно определены несколько параметров путем обработки одной кривой насыщения. Правда, чем больше число этих параметров, тем все более мощные математические методы решения обратных задач (такие, как метод искусственных нейронных сетей) необходимо применять для достижения удовлетворительной точности.
Нелинейная флуориметрия сохраняет в себе основные достоинства флуоресцентной спектроскопии - высокую чувствительность и возможность проводить измерения в дистанционном режиме.
Метод нелинейной флуориметрии только начал развиваться, и основные его успехи впереди.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986.
2. Фадеев В.В. // Вестн. МГУ. Сер. 3, Физика, астрономия. 1998. ╧ 4. С. 49-58.
3. Тихонов А.Н., Арсенин В.Я. Методы решения некорректных задач. М.: Наука, 1980.
4. Компьютеры в лаборатории / Под ред. А.В. Тихонравова. М.: Изд-во МГУ, 1992.
5. Ежов А.Н., Шумский С.А. Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. М.: МФТИ, 1998.
Рецензент статьи В.В. Михайлин
* * *
Виктор Владимирович Фадеев, доктор физико-математических наук, профессор кафедры квантовой радиофизики физического факультета МГУ. Лауреат Государственной премии СССР. Область научных интересов - лазерная спектроскопия водных сред, применение лазеров в экологии. Автор более 300 публикаций, одного открытия и четырех изобретений.
