|
|
Статьи Соросовского Образовательного журнала в текстовом формате
Рассмотрены история формирования и современное состояние везикулярной гипотезы освобождения медиатора в синапсе. Представлены данные по молекулярным механизмам образования, заполнения, опустошения и рециклизации везикул в нервном окончании.
ВЕЗИКУЛЯРНАЯ ГИПОТЕЗАОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА В СИНАПСЕ
А. Л. ЗЕФИРОВ
Казанский государственный медицинский университет
Одной из основных задач нейробиологии является выяснение механизмов, лежащих в основе передачи информации с одной нервной клетки на другую. В настоящее время всеобщее признание получила везикулярная гипотеза освобождения медиатора, по которой передача информации от одной возбудимой клетки к другой происходит за счет химического агента - медиатора, который концентрируется в синаптических везикулах и выделяется из них посредством экзоцитоза.
Для исследования роли везикул (секреторных гранул) в процессе межклеточной сигнализации проводят исследования на самых разнообразных объектах: межнейрональных синапсах центральной нервной системы позвоночных и безпозвоночных животных, нервно-мышечных синапсах, электрическом органе ската (модифицированная нервно-мышечная система), мозговом слое надпочечников, нейронах гипоталамуса и гипофиза. Оказалось, что освобождение медиаторов, гормонов и других биологически активных веществ осуществляется из везикул по схожим механизмам. Очевидно, что везикулярное освобождение биологически активных веществ (медиаторов, пептидов, гормонов) является универсальным механизмом межклеточных взаимодействий в организме животных и человека. Исключением является выделение из клеток стероидных и тироидных гормонов, а также простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов, которые способны проходить через липидный бислой клеточной мембраны. Рассмотрим роль везикул в функционировании синаптических образований.
Синапс. Термин "синапс" впервые введен выдающимся английским физиологом Чарлзом Шерингтоном в 1897 году после пионерских морфологических работ Рамон и Кахала, в которых впервые были получены свидетельства о том, что нервная система состоит из изолированным нервных клеток - нейронов. Слово "синапс" переводится с греческого как соединение, связь. В настоящее время под синапсом понимают специфическое место контакта (межклеточного мембранного соединения) одной возбудимой клетки с другой, в котором происходит процесс передачи информации путем изменения потенциала мембраны. Основным в нервной системе является химический синапс, названный так потому, что в этом виде соединений в процессе передачи информации участвует медиатор (синонимы - трансмиттер, передатчик, посредник). В таких синапсах одна клетка (пресинаптическая) обладает способностью синтезировать и выделять медиатор в окружающую среду (узкую щель между мембранами клеток - синаптическую щель), а другая (постсинаптическая) - воспринимать и отвечать на это вещество специфической реакцией в виде изменения своего мембранного потенциала (поляризацией) и возникновением постсинаптического потенциала. В настоящее время в центральной и периферической нервной системе обнаружено большое число медиаторов.
В самом общем виде комплекс сложнейших биохимических и биофизических молекулярных процессов, происходящих в синапсе, представлен на рис. 1. Эта схема касается синапсов, в которых синаптическая передача осуществляется с помощью таких медиаторов, как ацетилхолин, глютамат, гамма-аминомасляная кислота, глицин и биогенные амины (классические медиаторы). В пептидергических синапсах непосредственной передачи возбуждения обычно не происходит, а секретируемые пептиды изменяют (модулируют) возбудимость нервных клеток, их чувствительность к классическим медиаторам, изменяют их метаболизм.
Квантовая гипотеза освобождения медиатора. Для того чтобы понять, как формировалась везикулярная гипотеза, необходимо остановиться на квантовой гипотезе освобождения медиатора в синапсе. В 1953 году Бернард Катц с сотрудниками, исследуя нервно-мышечный синапс лягушки (медиатор - ацетилхолин), с помощью микроэлектродов зарегистрировали новый класс постсинаптических потенциалов. Эти сигналы возникали случайно, в покое, имели очень маленькую амплитуду и были названы миниатюрными потенциалами концевой пластинки (МПКП). Далее оказалось, что постсинаптические потенциалы, вызванные раздражением двигательного нерва (потенциалы концевой пластинки - ПКП), от раздражения к раздражению варьируют по амплитуде, причем эти колебания кратны амплитуде МПКП. Было предположено, что медиатор в синапсе освобождается в виде мультимолекулярных порций - квантов. В покое случайное освобождение из нервного окончания отдельных порций вызывает появление на постсинаптической мембране МПКП, а в ответ на раздражение происходит синхронное освобождение нескольких десятков или сот квантов и возникает ПКП. Электрофизиологическое определение показало, что квант медиатора состоит из 1000-10 000 молекул ацетилхолина. В дальнейшем квантовая гипотеза освобождения медиатора получила подтверждение на самых разнообразных объектах и в настоящее время считается общепризнанной.
Везикулярная гипотеза. Использование метода электронной микроскопии для изучения ультраструктуры синапса позволило в 1954 году Де Робертсу и Беннету выявить в цитоплазме двигательного нервного окончания большое количество синаптических везикул диаметром около 50 нм (рис. 2). Поскольку везикулы имели одинаковые размеры и концентрировались у пресинаптической мембраны, было предположено, что квант медиатора находится в синаптической везикуле, а освобождение медиатора происходит путем выделения содержимого везикулы в синаптическую щель путем экзоцитоза. Так была сформулирована везикулярная гипотеза освобождения медиатора в синапсе. В дальнейшем синаптические везикулы были обнаружены во всех химических синапсах нервной системы.
К основным постулатам везикулярной гипотезы необходимо отнести следующие: 1) медиатор в нервном окончании концентрируется в синаптических везикулах, 2) везикулярный медиатор освобождается путем слияния мембраны везикулы с пресинаптической мембраной (экзоцитоз).
Типы везикул. Как показали электронно-микроскопические исследования, самые разнообразные нервные окончания имеют два типа секреторных везикул: синаптические везикулы (мелкие везикулы) и секреторные гранулы (так называемые крупные или электронно-плотные везикулы) (рис. 2). Мелкие синаптические везикулы однородны по размерам и имеют малый диаметр (около 50 нм). Эти везикулы содержат классические медиаторы. Крупные, электронно-плотные везикулы имеют большой диаметр (около 100 нм), они неоднородны по размерам и содержат электронно-плотные гранулы, представляющие собой крупномолекулярные медиаторы - пептиды и белки (см. рис. 2).
Расположение везикул в синапсе. Первые электронно-микроскопические исследования показали, что существуют две группы мелких синаптических везикул в нервном окончании. Первая группа везикул находится в непосредственной близости от пресинаптической мембраны у электронно-плотных образований. Многочисленные ультраструктурные, биохимические и электрофизиологические данные показали, что именно в этих местах происходит освобождение медиатора. Поэтому электронно-плотные участки пресинаптической мембраны с фиксированными у них синаптическими везикулами получили название активных зон. Вторая группа везикул располагается на некотором удалении от активной зоны (см. рис. 2). Было предположено, что везикулы первой группы содержат запас медиатора, готового к освобождению, везикулы второй - мобилизационный запас, который пополняет первый в случае его расходования при активности синапса. Дальнейшая детализация топографии везикул в нервном окончании была проведена при помощи метода замораживания - скалывания (см. рис. 2). Этот метод заключается в том, что замороженный кусочек ткани раскалывают острым ножом, а поверхность скола рассматривают под электронным микроскопом. Поскольку замороженная ткань раскалывается по мембранам, то можно получить детальную ультраструктурную реконструкцию пре- и постсинаптических отделов синапса. Оказалось, что в области активной зоны в пресинаптической мембране концентрируются крупные внутримембранные частицы, около которых располагаются синаптические везикулы. Многочисленные данные указывают на то, что эти частицы являются кальциевыми каналами, которые обеспечивают временное увеличение концентрации ионов кальция в области синаптических везикул при возбуждении, ведущее к освобождению медиатора. Топография активных зон, внутримембранных частиц и везикул в различных синаптических образованиях неодинакова и сильно варьирует от симметричного и упорядоченного расположения до хаотичного. Наиболее красивой и изящной в этом отношении является активная зона нервно-мышечного синапса лягушки, в которой крупные внутримембранные частицы располагаются в виде двух двойных параллельных рядов, идущих поперек нервного окончания, по краям которых располагаются синаптические везикулы (см. рис. 2). При синаптической активности в этих местах появляются кратеры и протуберанцы, свидетельствующие об экзоцитозе синаптических везикул. Всего в двигательном нервном окончании лягушки может быть несколько сот активных зон, расположенных на расстоянии 1 мкм друг от друга. Крупные везикулы, содержащие медиаторы пептидной природы, располагаются вне активных зон (см. рис. 2).
Формирование везикул. Синаптические везикулы образуются в теле нервной клетки из эндоплазматического ретикулума и цистерн аппарата Гольджи, а затем транспортируются по аксону в нервные окончания. По всей видимости, принципиальной разницы в формировании различных типов везикул, заполненных различными медиаторами, не наблюдается. Различия касаются только заполнения и механизмов опустошения везикул (рис. 3).
Заполнение везикул. Как показали биохимические исследования, медиатор в мелких синаптических везикулах находится в очень высокой концентрации - 100 ммоль/л. Это достигается наличием в мембране везикулы специальных активных транспортных систем. В мембране везикулы имеется протонный насос, который, используя энергию АТФ, создает разность потенциалов на мембране везикулы (содержимое везикулы заряжено положительно по сравнению с цитоплазмой нервного окончания). Везикулы содержат также хлорные каналы. Электрохимический градиент, формируемый протонным насосом, обеспечивает активный транспорт медиатора, который синтезируется в цитоплазме нервного окончания, в везикулу (см. рис. 3). В настоящее время выделены несколько классов таких транспортных молекул, специфичных для биогенных аминов, ацетилхолина, глютамата, ГАМК и глицина. Наряду с медиатором в везикулах находятся АТФ, ионы, ферменты и другие компоненты.
Что касается крупных, электронно-плотных везикул, то их заполнение белковыми компонентами начинается уже в процессе образования везикул из эндоплазматического ретикулума. Синтез нейроактивных пептидов происходит подобно синтезу пептидных гормонов. Первоначально крупные аминокислотные последовательности (пептидные цепи) образуются на рибосомах, подобно прегормонам, и помещаются в эндоплазматический ретикулум. В цистернах аппарата Гольджи начинается протеолитический процесс разделения крупных полипептидов на фрагменты с образования активных пептидов, которые включаются в отпочковывающиеся везикулы (см. рис. 3). Причем разные нейроактивные пептидные фрагменты могут оказаться в различных везикулах, которые транспортируются в нервные окончания нейрона. Во многих нейронах медиаторы и нейропептиды синтезируются и упаковываются в одни и те же везикулы, следовательно, из их нервных окончаний освобождаются несколько различных медиаторов. Эти наблюдения позволяют усомниться в правильности принципа Дейла (1935 год), который гласит, что все нервные окончания, образованные одним нейроном, секретируют только один медиатор.
Опустошение везикул и освобождение медиатора. Если постулат о том, что синаптическая везикула является резервуаром для медиатора, не поддается сомнению, то механизм освобождения медиатора из везикулы в синаптическую щель вызывает большие споры и соответственно появление большого количества гипотез и спекуляций.
На рис. 4 представлены три принципиальных механизма освобождения медиатора с участием синаптической везикулы, посредством которых содержимое везикулы может выделиться в синаптическую щель в области активной зоны. Все три механизма зависимы от ионов кальция, так как непосредственной причиной выделения кванта медиатора является увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция в месте освобождения медиатора за счет открытия кальциевых каналов при деполяризации пресинаптической мембраны потенциалом действия.
Первый механизм представляет собой типичный экзоцитоз. Он сопровождается полным слиянием везикулы и встраиванием ее мембраны в пресинаптическую. В этом случае все содержимое везикулы оказывается в синаптической щели (медиатор, АТФ, ионы, белки и ферменты), а бывшая внутренняя поверхность мембраны везикулы обращена в сторону синаптической щели.
Второй механизм - это экзоцитоз без полного слияния, с частичным освобождением (шутливо названный "кратковременным поцелуем"). Он характеризуется формированием временной поры (канала) между внутренностью везикулы и окружающей средой. В этом случае через образованную пору по градиенту концентрации медиатор будет диффундировать в синаптическую щель. Причем количество выделенного медиатора (величина кванта) зависит от времени, в течение которого пора находится в открытом состоянии. Предполагают, что везикула при каждом контакте с пресинаптической мембраной через временную пору теряет только часть своего содержимого и может многократно участвовать в экзоцитозе. Поскольку пора обладает селективностью, то другие ингредиенты внутривезикулярной среды при этом виде экзоцитоза в синаптическую щель не выделяются.
Третий механизм предполагает наличие специфического белка (медиатофора) или канала, встроенного в пресинаптическую мембрану и способного освобождать медиатор из цитоплазмы нервного окончания. В этом случае везикулы выполняют не связанную с экзоцитозом функцию (содержат резервный медиатор, который при необходимости поступает в цитоплазму нервного окончания). Каждый из этих механизмов среди исследователей имеет своих приверженцев и подтверждается научными наблюдениями. Возможно, в различных образованиях и для различных везикул существуют разные механизмы освобождения медиатора.
Рециклизация везикул. Под процессом рециклизации понимают процесс повторного образования, заполнения и использования везикул после их опустошения и экзоцитоза. Если считать, что освобождение медиатора происходит путем экзоцитоза с полным слиянием, то естественно, что при активности синапса будет происходить уменьшение количества и в конечном итоге исчезновение везикул. Однако в нервном окончании наряду с процессом экзоцитоза осуществляется также эндоцитоз, то есть процесс образования новых везикул из фрагментов пресинаптической мембраны. Для мелких везикул этот процесс заключается в том, что после экзоцитоза из фрагмента пресинаптической мембраны путем эндоцитоза образуется везикула, которая через стадию эндосомы вновь заполняется медиатором и может участвовать в освобождении медиатора (см. рис. 3). В модели экзоцитоза без полного слияния рециклизация заключается в отхождении опустошенной везикулы от пресинаптической мембраны и повторном заполнении ее медиатором. Процесс рециклизации везикул достаточно быстрый и занимает не более 1 мин. Крупные, электронно-плотные везикулы, заполненные пептидами, не могут восстанавливаться после экзоцитоза (см. рис. 3).
Кальциевые каналы и экзоцитоз. Процесс освобождения медиатора зависит от ионов кальция. В покое внутриклеточная концентрация ионов кальция ничтожно мала, что связано с функционированием мощных внутриклеточных систем, связывающих свободные ионы кальция (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, синаптические везикулы), а также системы активного транспорта кальция из нервного окончания. При возбуждении происходит кратковременное открытие кальциевых каналов и поступление ионов кальция в нервное окончание. Эти ионы, взаимодействуя со специфическими белками синаптической везикулы и пресинаптической мембраны, инициируют экзоцитоз и освобождение медиатора. Для осуществления экзоцитоза необходимо создание критической (достаточно высокой) концентрации ионов кальция у везикулы в очень короткий промежуток времени. Нетрудно представить, что вероятность экзоцитоза везикулы будет зависеть от количества кальциевых каналов у везикулы и расстояния от канала до места экзоцитоза. Учитывая, что в цитоплазме нервного окончания диффузия ионов кальция от канала происходит очень быстро, а эффективность кальцийсвязывающих систем очень высока, критическая концентрация кальция создается только у некоторых везикул, поэтому вероятность освобождения медиатора невелика. Так, в активной зоне нервно-мышечного синапса лягушки, содержащей около 50 готовых для экзоцитоза везикул и около 200 кальциевых каналов, в ответ на возбуждение в естественных условиях подвергается экзоцитозу не более одной везикулы. Поскольку в нервном окончании лягушки имеется несколько сот активных зон, то в ответ на нервный импульс экзоцитоз может наблюдаться одновременно в ста и более везикулах с освобождением большого количества медиатора. В центральных синапсах, имеющих малое количество активных зон, при возбуждении освобождается только несколько квантов медиатора.
Молекулярная машина экзоцитоза. В настоящее время считают, что освобождение медиатора посредством экзоцитоза включает в себя четыре основных этапа (рис. 5): 1) транспорт (мобилизация) везикулы, заполненной медиатором из резервного запаса в запас, доступный к освобождению, располагающийся у активной зоны; 2) стыковка (докирование) везикулы с местом освобождения у активной зоны; 3) слияние мембраны везикулы с плазматической мембраной (экзоцитоз); 4) рециклизация везикулы посредством эндоцитоза.
В первом этапе принимает участие целое семейство белков-синапсинов, которые связываются с актиновыми нитями цитоскелета и мембраной синаптической везикулы. Фосфорилирование синапсина Са/кальмодулинзависимой протеинкиназой 11 или протеинкиназой А уменьшает эту связь и обеспечивает транспорт везикулы к месту освобождения.
Три класса белков играют важную роль в стыковке и экзоцитозе - это белки мембраны синаптической везикулы синаптобревин и синаптотагмин, а также белки пресинаптической мембраны SNAP-25 и синтаксин, взаимодействующие с кальциевыми каналами.
Большое значение в процессах транспорта и стыковки везикул в настоящее время отводится семейству p21ras белков и его представителям - Rab3. Считают, что этот гуанозинтрифосфат (ГТФ), связывающий белок, взаимодействует с белками экзоцитоза синаптической везикулы и предотвращает стыковку везикулы с белками, формирующими пору слияния. Активация ГТФазы ведет к диссоциации этого белка, прекращению этого взаимодействия, что приводит к стыковке и экзоцитозу синаптической везикулы.
В третьем этапе участвует также синаптофизин, везикулярный белок, состоящий из четырех трансмембранных сегментов. Этот белок способен формировать каналы в искусственных липидных мембранах, поэтому считают, что он участвует в формировании временной поры между секреторной везикулой и плазматической мембраной. По всей видимости, синаптофизин выполняет определенную роль и в четвертом этапе - рециклизации везикулы. Одна из многочисленных схем, объясняющих участие различных белков в процессе экзоцитоза синаптической везикулы, представлена на рис. 5.
Таково современное состояние везикулярной гипотезы освобождения медиатора в синапсе. Представленные данные позволяют считать, что передача возбуждения в синапсе осуществляется за счет химических посредников - медиаторов, которые концентрируются в синаптических везикулах и освобождаются из нервных окончаний посредством экзоцитоза. Благодаря внедрению новых научных технологий и усилиям ученых различных специальностей в ближайшие годы можно ожидать значительных научных успехов и достижений в этой области нейробиологии.
Рецензент статьи В.А. Ткачук
* * *
Андрей Львович Зефиров, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета, заслуженный деятель науки Республики Татарстан, лауреат государственной премии Республики Татарстан. Область научных интересов - нейрофизиология и синаптология. Автор более 200 публикаций.
